CAR T 細胞療法已經(jīng)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了巨大成功，但目前尚未在實體瘤中取得成果。主要由于血液瘤與實體腫瘤之間存在著明顯的差異。例如，在實體腫瘤中存在較少的靶抗原。另外許多實體瘤是 “冷”腫瘤，免疫細胞對TME的浸潤性很差。由于免疫抑制的TME，即使有大量免疫細胞浸潤到腫瘤中，免疫細胞也不能很好的發(fā)揮作用。

與CAR T細胞相比，CAR NK細胞有幾個優(yōu)勢，包括免疫細胞來源豐富，沒有GvHD等優(yōu)勢。然而與CAR T細胞治療相關的大多數(shù)障礙也適用于CAR NK細胞。由于CAR T和CAR NK細胞治療的這些障礙，最近 CAR macrophages已成為一種替代療法。雖然 CAR macrophages與CAR T細胞有許多共同的特征和障礙，如對特異性抗原的需求、抗原逃逸和下調(diào)以及全身性細胞因子毒性等。然而，與CAR T細胞相比，CAR macrophages在實體腫瘤治療兩個主要障礙上具有獨特的優(yōu)勢：免疫細胞向TME的遷移和浸潤，以及免疫抑制TME(表1)。本文就CAR macrophages的獨特優(yōu)勢，CAR結構，以及近年來的進展做一個簡要介紹。

表1. CAR T、NK和macrophages的比較

對于免疫細胞向TME的遷移和浸潤，巨噬細胞在許多腫瘤中大量存在，而不像T細胞的低遷移和浸潤。新鮮的冰凍腫瘤切片顯示，在許多癌癥類型中，巨噬細胞占腫瘤浸潤性細胞的大部分，在黑色素瘤、腎細胞癌和結直腸癌中高達50%。巨噬細胞在TME的浸潤得益于腫瘤部位許多細胞因子的分泌。低氧誘導腫瘤細胞和基質(zhì)細胞產(chǎn)生的細胞因子，如CCL2、CXCL12、CSF1和VEGF可以募集巨噬細胞。一旦被招募到低氧的TME中，這些可溶性因子的受體被下調(diào)，從而將巨噬細胞鎖定在TME中。此外，巨噬細胞可以直接感知低氧條件及其代謝產(chǎn)物，如低pH值，并遷移到TME。

TME的另一個主要障礙是免疫抑制微環(huán)境，這對T細胞來說是一個主要障礙，但對巨噬細胞來說不是那么重要。由于免疫抑制微環(huán)境，浸潤到腫瘤部位的T細胞通常會出現(xiàn)衰竭表型，而且免疫檢查點抑制劑經(jīng)常無法逆轉(zhuǎn)這種表型。巨噬細胞的情況可能并非如此。巨噬細胞大致分為兩大類，經(jīng)典激活的促炎M1巨噬細胞和交替激活的抗炎M2巨噬細胞。TAMs，特別是M2 TAMs，被廣泛認為是TME的中樞免疫抑制細胞群之一。雖然M2巨噬細胞抑制了其他免疫細胞的功能，但它們自身仍具有吞噬能力。事實上，M2巨噬細胞的吞噬能力高于M1巨噬細胞。此外，巨噬細胞具有較高的表型可塑性，這使得它們能夠?qū)Νh(huán)境刺激做出反應并改變表型。

CAR macrophages中的CAR具有與CAR T細胞相同的結構，具有細胞外抗原結合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(圖1)。但它們在細胞內(nèi)的信號域上有所不同。CAR macrophages可以直接使用包含 ITAM的CD3ζ結構域。在CAR T細胞中，當CAR參與時，ITAM被Src家族的激酶磷酸化，結合到激酶ZAP70中的串聯(lián)SH2(tSH2)結構域，并激活CAR T細胞以發(fā)揮細胞殺傷作用。巨噬細胞不表達ZAP70，而表達另一種含有tSH2結構域的激酶Syk，可以與CD3ζ結合，并在巨噬細胞中傳遞吞噬信號。

圖1. CAR macrophages的CAR結構

除了CD3ζ ITAM，其他含ITAM的胞內(nèi)結構域，如Fc受體的γ亞單位(FcRγ)和Megf10也被使用，并能誘導與CD3ζ類似的吞噬作用。FcRγ轉(zhuǎn)導巨噬細胞中抗體依賴的細胞吞噬作用的典型信號。Megf10在巨噬細胞吞噬凋亡細胞過程中起關鍵作用。

與第二代和第三代CAR T細胞類似，一個額外的信號域也可以增強吞噬功能，并在 CAR macrophages中觀察到類似的發(fā)現(xiàn)。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路對巨噬細胞吞噬大顆粒很重要。研究發(fā)現(xiàn)CD19 PI3K-Recruiting結構域與CAR FCRγ的串聯(lián)融合可使吞噬功能增加兩倍。

到目前為止， CAR macrophages還處于起步階段，基本上還都處于臨床前階段。只有一項使用自體 CAR macrophages靶向HER2過表達實體瘤的I期臨床試驗正在進行（表2)。

表2. CAR macrophages的臨床前和臨床研究

Morrissey等人系統(tǒng)的分析了CD19和CD22靶向的 CAR macrophages的胞內(nèi)結構域。研究發(fā)現(xiàn)含有ITAM的 CD3ζ、FcRγ或Megf10任何一個胞內(nèi)結構域的CAR macrophages，具有相似的吞噬效率，而含有Bail和MerTK胞內(nèi)區(qū)的 CAR macrophages則不能與靶細胞結合。大多數(shù) CAR macrophages只內(nèi)化靶細胞的碎片，整個細胞被吞噬的情況很少見。含有FcRγ-PI3K募集結構域的CD47可增強巨噬細胞的吞噬功能，但孵育4~8h后，仍只有不到10%的巨噬細胞含有完整的靶細胞。

Klichinsky等人報道了基于CD3ζ的抗HER2 CAR macrophages的產(chǎn)生和特性。在該研究中，使用腺病毒載體可以將CAR高效地轉(zhuǎn)染到巨噬細胞。腺病毒感染誘導 CAR macrophages 向M1分化，使TME向促炎表型傾斜。此外，腺病毒轉(zhuǎn)導的 CAR macrophages作為專業(yè)的抗原提呈細胞，除了靶抗原外，還可以交叉遞送腫瘤來源的抗原，以更有效地激活T細胞。體內(nèi)實驗證實了這些 CAR macrophages顯著延長了攜帶腫瘤移植物的小鼠的存活時間，并減少了肺轉(zhuǎn)移。

L. Zhang等人報道的一項研究，解決了使用誘導多能干細胞(iPSCs)來源的 CAR macrophages進行癌癥免疫治療效率低的問題。在本研究中，用編碼重編程因子的非整合載體誘導iPSC克隆。然后將含有CD86和FcRγ胞內(nèi)區(qū)的CAR基因?qū)雐PSC誘導的巨噬細胞。這些iPSC衍生的表達CAR的巨噬細胞(CAR-iMACs)具有M2表型。然而，一旦與靶細胞相遇，這些CAR-iMACs就會吞噬靶癌細胞，并向促炎癥的M1表型傾斜。體內(nèi)研究表明，CAR-iMACs能夠擴增、持續(xù)存在并發(fā)揮其抗腫瘤活性。

W. Zhang等人使用 CAR macrophages解決了由于細胞外基質(zhì)(ECM)導致的免疫細胞對腫瘤浸潤不足的問題。ECM為T細胞浸潤到腫瘤部位并發(fā)揮其抗癌免疫作用創(chuàng)造了一個物理屏障。靶向癌癥相關成纖維細胞或基質(zhì)降解酶--肝素酶的CAR T細胞可以促進免疫細胞的浸潤，增強抗腫瘤免疫。在W. Zhang使用的 CAR macrophages中，靶向HER2的單鏈抗體連接了鉸鏈區(qū)、CD147跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，從而產(chǎn)生CAR-147 macrophages（圖2）。CD147通過表達基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對ECM重塑起重要作用。由于CD147不傳遞吞噬信號， CAR macrophages與靶細胞的結合顯著上調(diào)了某些MMPs的表達，但不影響巨噬功能。與體外實驗結果一致，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)CAR-147巨噬細胞上調(diào)了某些MMPs的表達，顯著降低了腫瘤中的膠原含量，增加了T細胞的浸潤，并抑制了腫瘤的生長。

圖2. CAR-147 macrophages的產(chǎn)生及作用機制示意圖

Niu等人報道了一項利用 CAR macrophages靶向表達CCR7的免疫抑制細胞用于癌癥免疫治療的研究。該小組設計了表達CCR7天然配體CCL19作為胞外區(qū)的 CAR macrophages，以靶向表達CCR7的免疫抑制細胞。為了建立一個最佳的CAR結構域，使用并比較了下列胞內(nèi)結構域：TLR2、TLR4、TLR6、MerTK或經(jīng)典的CAR-T激活結構域4-1BB-CD3ζ。含MerTK的 CAR macrophages體外吞噬和殺傷活性最強。低劑量便能誘導T細胞進入腫瘤、增加促炎細胞因子的產(chǎn)生、抑制腫瘤生長和減少轉(zhuǎn)移且毒性較小。

到目前為止，只有一項針對 CAR macrophages的I期臨床試驗(NCT04660929)。這項臨床試驗是基于Klichinsky等人開發(fā)的 CAR macrophages。本試驗使用的是腺病毒載體Ad5f35改造的 CAR macrophages，并攜帶靶向HER2的單鏈抗體。腺病毒感染誘導巨噬細胞分化為促炎癥的M1樣表型。這項臨床試驗已于2021年2月開始。到目前為止還沒有更多的結果報告，我們期待后續(xù)的臨床進展。

CAR macrophages的研究仍處于初級階段，目前只有一項臨床試驗啟動，尚未有結果報告。因此，許多可能最多的限制尚未顯現(xiàn)。目前正在已經(jīng)進行大量的工作，以優(yōu)化 CAR macrophages的結構、制造、儲存、腫瘤浸潤和在TME的細胞毒性。使用CAR macrophages的主要優(yōu)點是它易于遷移和浸潤到腫瘤中，而且促炎癥的M1表型和抗炎的M2表型之間具有可塑性?？傊?，我們期待CAR macrophages的更多進展，也許它在解決CAR T和CAR NK治療未被滿足的臨床需求方面是一個非常好的選擇。

參考文獻

1.CAR race to cancer immunotherapy: from CAR T, CAR NK to CAR macrophage therapy.

2.CAR-macrophage: A new immunotherapy candidate against solid tumors.

3.Chimeric antigen receptors that trigger phagocytosis.

4.Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy.

5.Pluripotent stem cell derived CAR macrophage cells with antigen?dependent anti?cancer cell functions.