1. GMP法規(guī)

近年來，CAR-T療法在血液瘤治療方面表現(xiàn)出令人鼓舞的結果，2017年美國FDA批準了兩款CAR-T細胞產品上市，極大地鼓舞了細胞免疫治療研發(fā)熱情，CAR-T療法在某些血液腫瘤中具有顯著的療效，并預示著腫瘤治療模式的變革。CAR-T細胞療法在其它惡性腫瘤方面也進行了深入的研究，部分產品已開展了早期臨床試驗，以評估CAR-T細胞的安全性和有效性。FDA規(guī)定CAR-T細胞臨床試驗樣品必須經IND批準在GMP條件下生產。

GMP法規(guī)見美國Federal Regulations第21篇的各個章節(jié)。它們涵蓋各種產品的制造，包括食品、小分子藥物等。CAR-T最相關的章節(jié)在第210和211部分中介紹，在FDA指南“CGMP for Phase I Investigational Drugs”中簡要介紹了用于早期臨床試驗的生產要求。討論的關鍵領域如表1所示，其中包括一個專門的章節(jié)，涵蓋與細胞和基因治療產品相關的問題。

2. 廠房及設施

用于制造、加工或包裝CAR-T的任何建筑或設施應具有適當?shù)某叽?、位置，并采用適當?shù)臐崈羰壹壊牧辖ㄔ?，以確保適當?shù)那鍧崱⒕S護和生產操作。制造設施中的每個指定工作區(qū)域必須有適當?shù)目臻g供設備、材料和人員移動，以防止不同部件、過程中材料或不同CAR-T產品之間的混合，從而有助于防止污染。如果使用多產品制造設施，則需要進行適當?shù)慕徊嫖廴狙芯框炞C。

CAR-T細胞治療產品、病毒載體和質粒的生產應當分別在各自獨立的生產區(qū)域進行，并配備獨立的空調凈化系統(tǒng)。采用密閉設備、管路進行細胞治療產品的生產操作；密閉設備、管路安置環(huán)境的潔凈度級別可適當降低。同一生產區(qū)域有多條相同的生產線，且采用隔離器的，每個隔離器應當單獨直接排風。細胞治療產品、病毒載體、質粒的生產操作環(huán)境的潔凈度級別，可參照表格中的示例進行選擇。

每個B實驗區(qū)域的空氣壓力保持在+50Pa大氣壓，每個級別的實驗區(qū)域都有一個10-15Pa的空氣級聯(lián)，沒有空氣再循環(huán)；新鮮空氣通過終端Hepa過濾器進入每個實驗區(qū)域，并通過低水平抽風器排出。換氣速率從B實驗區(qū)的70ac/H到D實驗區(qū)的28ac/H不等。每個II類微生物安全柜和提供A級環(huán)境的QUBE隔離器都進行連續(xù)的顆粒監(jiān)測。每個實驗室都要與其他實驗室完全隔離，以便用汽化過氧化氫進行熏蒸。

目前CAR-T產品常見的生產環(huán)境有兩種：B+A和C+A（隔離器），需要明確的是，無論是哪種實現(xiàn)形式，按照無菌生產要求，所有生產環(huán)節(jié)不能離開A級環(huán)境，這就要求對無菌生產要有充分的理解，否則將面臨合規(guī)性方面的挑戰(zhàn)。

B+A是大家首先考慮的生產環(huán)境實現(xiàn)形式，但這種方式面臨一個問題是不能保證全程在A級環(huán)境下完成。C+A是現(xiàn)階段CAR-T產品無菌生產的一種理想方案。細胞制品生產過程中的隔離措施以隔離器為最佳，無菌生產的隔離器對環(huán)境的要求可以降低，而且可以將離心、培養(yǎng)等關鍵環(huán)節(jié)集成在隔離器內，實現(xiàn)全程的A級隔離。

在這些區(qū)域使用的材料和設備必須盡量減少顆粒物（使用潔凈室級鋼、其他材料等）和生物或化學污染的機會。應監(jiān)測周期性好氧和厭氧微生物負荷。

空氣處理裝置必須配備適當?shù)脑O備，并通過書面文件、測試和定期維護對區(qū)域等級進行驗證。不同等級區(qū)域的空氣處理裝置應根據其各自的管道而有所不同。

生產區(qū)和灌裝區(qū)必須明確劃分和隔離（必須保持人員和物料流動的標準操作程序）。必須將適當?shù)念w粒計數(shù)器、微生物傳感器、空氣流量傳感器等放置在制造設施的工作區(qū)域，并保存記錄。

用于生產的潔凈室區(qū)域內的所有儀器必須有校準標準操作規(guī)程，并提供定期維護的文件。設施必須定期進行空氣過濾器、儀器等的維護驗證，以確認指定的分類區(qū)域的維護。

工藝標準操作規(guī)程必須包括安全方法，防止污染，定期測試污染物、微粒和風險最小化的方法。生產過程中的所有數(shù)據必須在有權限訪問下安全存儲，并在評估過程中提供。

3. 人員

生產負責人應當具有相應的專業(yè)知識（如微生物學、細胞生物學、免疫學等），至少具有三年從事生物制品或細胞治療產品生產或質量管理的實踐經驗。質量負責人和質量受權人應當具有相應的專業(yè)知識，至少具有五年生物制品或細胞治療產品生產、質量管理的實踐經驗，從事過生物制品或細胞治療產品質量保證、質量控制等相關工作。

從事細胞治療產品生產、質量保證、質量控制及其他相關人員（包括清潔、維修人員）應當經過接受良好的無菌程序、污染物測試、生產過程（根據批準的標準操作規(guī)程）和維護所有過程相關文件方面的培訓。尤其是預防經供體材料傳播疾病方面的知識，以防止傳染性疾病的病原體在物料、產品和人員之間傳播以及對環(huán)境潛在的影響。

負責制造、相關工藝、包裝或搬運的人員必須在制造設施內始終穿著干凈、安全和適當?shù)囊路⒈３譄o菌條件（應制定人員進出的標準操作規(guī)程）。必要時，應穿戴覆蓋身體、頭部、面部、手和手臂的防護服，以防止產品受到污染（必須制定標準操作規(guī)程）。員工必須養(yǎng)成良好的衛(wèi)生和健康習慣。從事質粒和病毒載體制備和細胞治療產品生產的人員不得穿越不同的生產區(qū)域。

4. GMP條件下CAR-T生產

4.1 生產流程

在設計CAR-T 細胞制造SOP時，特別建議開發(fā)一個封閉的，或功能封閉的制造過程，以降低產品污染的風險。

從在簡單的T瓶和細胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)到在復雜的生物反應器中制備，理想的系統(tǒng)應該在功能上是封閉的，以減少污染的風險，因此，大多數(shù)研究人員已經放棄使用T形瓶。目前，應用最廣泛的培養(yǎng)設備是G-Rex（Wilson Wolf Manufacturing）、Wave biorector（GE Life Systems）和CliniMACS Prodigy（Miltenyi Biotec）。

G-Rex專為懸浮細胞培養(yǎng)設計，氧氣從底部透氣膜滲透進入培養(yǎng)體系，細胞自然沉降至培養(yǎng)瓶底部，葡萄糖等營養(yǎng)物質自然對流至細胞，細胞可以用GatherRex（Wilson Wolf Manufacturing）收集至轉移包中進行下游處理。

旭日（Wave）生物反應器是一個自動化的封閉系統(tǒng)，由一個放置在搖擺平臺上的透氣細胞培養(yǎng)袋組成。該系統(tǒng)配備流量控制器、氣體壓力傳感器、pH、氧氣和二氧化碳濃度傳感器等裝置。已經成功地用于生產CAR-T，該系統(tǒng)可用于生產1-1000升的產品。

CliniMACS Prodigy全自動多功能細胞處理系統(tǒng)符合歐盟GMP標準，全封閉操作系統(tǒng)，取代傳統(tǒng)方案中多個人工操作環(huán)節(jié)及相應的儀器設備，輕松實現(xiàn)標準化、全自動CAR-T細胞制備過程，包括細胞富集、轉導、洗滌和擴增，是目前應用最廣泛的自動化設備。在Prodigy裝置中，MACS CD4和CD8用于細胞富集，CD3/CD28試劑用于激活，慢病毒載體用于細胞轉導，這些細胞在TexMACS培養(yǎng)基-3%HS-IL2中培養(yǎng)，洗滌步驟采用PBS/EDTA緩沖液。用Prodigy裝置對起始細胞進行洗滌，去除血小板，富集CD4+和CD8+細胞。約10%的CD8+ NK細胞經CD3/CD28活化和擴增后大量清除。

4.2 生產控制

企業(yè)應當建立書面操作規(guī)程，規(guī)定供體材料和產品在接收、運輸、生產、檢驗、放行、發(fā)放過程中正確標識與核對標識信息的操作和記錄，確保可識別供體且具有唯一性的編號代碼，不會發(fā)生標識錯誤或遺漏，且具有可追溯性。企業(yè)應當制定供體篩查標準，制訂供體材料采集、運輸、接收標準操作規(guī)程，詳細說明供體材料的采集方法、保存和運輸條件以及接收的標準。

產品生產過程中應當采取措施盡可能防止污染和交叉污染，如：采用含有傳染性疾病病原體的自體供體材料進行生產的，其生產、轉運過程中不得接觸其它不含有傳染性疾病病原體的供體材料或產品；未采用密閉設備、管路生產的，不得在同一區(qū)域內同時進行多個產品或多個批次的生產操作，但產品已密封的培養(yǎng)操作除外；采用密閉設備、管路在多條生產線上同時生產同一品種的多個批次時，應當采取有效措施規(guī)范人員、物料和廢棄物的流向；在密閉條件下進行細胞培養(yǎng)的，同一培養(yǎng)箱內可同時培養(yǎng)和保存不同品種、不同批次的產品，但應當采取有效措施避免混淆；在非密閉條件下進行細胞培養(yǎng)的，同一培養(yǎng)箱只可培養(yǎng)和保存同一批次的產品。

生產過程中的中間產品和物料的轉運有特殊要求的，如溫度，應當對轉運條件有明確的規(guī)定，并有相應的轉運記錄。

4.3 質量控制

應建立質量控制（QC）流程和程序，以確保最終產品的質量。QC應通過適當?shù)臋z測以確保每批生產所有關鍵工藝步驟符合中控標準并保持無菌，并確保使用的所有物料符合規(guī)定的標準。應當建立安全、有效處理不合格供體材料、中間產品、成品、過期留樣樣品的操作規(guī)程，處理應當有記錄。細胞治療產品放行前的質量評價應當確認每批產品的信息完整、正確且可追溯，否則不得放行。

圖4 CAR-T質控

參考文獻： [1]. Gee, A. P. (2018). GMP CAR-T cell production. Best Practice & Research Clinical Haematology, 31(2), 126–134. [2].https://cdn.ymaws.com/isctglobal.org/resource/resmgr/regionalpageresources/national_guidelines_for_gene.pdf [3]. https://wenku.baidu.com/view/8ca7fbd12aea81c758f5f61fb7360b4c2e3f2a76.html