這是我們嘗試推出的一個全新系列?！斑B環(huán)畫”中的每一篇都會介紹一個最新生物醫(yī)藥技術(shù)或趨勢。以圖畫為主，文字為輔。雖然無法做到系統(tǒng)全面，但希望能給讀者帶來一些啟發(fā)。每篇文章只代表作者個人的觀點或解讀，與禮來亞洲基金的投資決定無關(guān)。

1 CAR-T細(xì)胞療法是近幾年來一種新興的癌癥治療方法：患者的T細(xì)胞在實驗室中通過基因工程改造后，能夠識別、結(jié)合其癌細(xì)胞上的特定蛋白（抗原），并啟動程序殺死這些癌細(xì)胞。整個流程主要分5步：（1）抽取患者的血液，從中提純T細(xì)胞；（2）在實驗室中將稱為嵌合抗原受體（CAR）的基因引入到T細(xì)胞中——這種在細(xì)胞膜上表達(dá)人工設(shè)計的CAR蛋白的細(xì)胞，就成為了CAR-T細(xì)胞；（3）在實驗室中培養(yǎng)、繁殖數(shù)百萬個CAR-T細(xì)胞；（4）通過靜脈注射將CAR-T細(xì)胞重新輸入患者體內(nèi)；（5）CAR-T細(xì)胞與癌細(xì)胞上的抗原結(jié)合后，拉響“警報”，進(jìn)入戰(zhàn)斗狀態(tài)，最終將癌細(xì)胞殺死。

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2   相對于藥物療法，細(xì)胞療法的優(yōu)勢是細(xì)胞可以完成更復(fù)雜的任務(wù)，而且療效持久——注射一次，可以維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。其缺點是生產(chǎn)過程復(fù)雜。而且如果是異體細(xì)胞移植，還需要克服來自宿主的免疫系統(tǒng)排斥。也正是因為這點，大部分細(xì)胞療法，包括CAR-T，使用的是患者自己的擴(kuò)增、改造或加工過的細(xì)胞。

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3   CAR-T細(xì)胞療法是一個典型的“模仿自然，高于自然”的創(chuàng)新。CAR蛋白的設(shè)計建立在T細(xì)胞受體（TCR）的基礎(chǔ)上，但在機(jī)理上又?jǐn)[脫了MHC/HLA的限制，并引進(jìn)了CD28、4-1BB等結(jié)構(gòu)元素。CAR蛋白一般具有以下幾個結(jié)構(gòu)域：（1）細(xì)胞膜外的抗原識別片段：多為單鏈可變片段(scFv)，相當(dāng)于一個小抗體；（2）scFv和跨膜域之間的聯(lián)結(jié)區(qū)：其長短會影響CAR-T的活性；（3）跨膜域：聯(lián)結(jié)CAR膜外結(jié)構(gòu)與膜內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)；（4）共刺激域：從第二代CAR-T開始引進(jìn)，有加強(qiáng)細(xì)胞因子表達(dá)、促進(jìn)T細(xì)胞增殖的功能；(5) 信號傳導(dǎo)域：可激活T細(xì)胞，引起對癌細(xì)胞的殺傷作用。

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4 和其它高科技產(chǎn)品一樣，CAR-T技術(shù)也在被不斷改進(jìn)，不斷換代。CAR蛋白是近年來技術(shù)改進(jìn)的主攻方向。第一代CAR沒有共刺激域，所以在結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原后，CAR-T繁殖不夠，不能持久，并且不能分泌足夠多的細(xì)胞因子。因此第一代CAR-T對腫瘤細(xì)胞的殺傷力不夠，最終未能進(jìn)入市場。第二代CAR裝備了CD28或4-1BB共刺激域——目前市場上的兩個產(chǎn)品都是第二代CAR-T。第三代CAR既有CD28又有4-1BB，具有更強(qiáng)、更持久的殺傷力。

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5 CAR-T對腫瘤細(xì)胞的殺傷力來源于CAR激活后啟動的信號傳導(dǎo)通路。在CAR-T表面的CAR與腫瘤細(xì)胞表面的特定抗原結(jié)合后，通過一系列信號傳導(dǎo)，或分泌多種細(xì)胞因子，或釋放顆粒酶、穿孔素等蛋白，從而引起腫瘤細(xì)胞的自殺。

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6   迄今為止，已有兩個CAR-T產(chǎn)品進(jìn)入市場: Kymriah^TM和Yescarta^®。二者都是第二代CAR-T，一個重要的區(qū)別是它們的CAR蛋白的共刺激域不同。兩個產(chǎn)品在臨床上的不同表現(xiàn)也許是源于這一差異：Yescarta^®在病人體內(nèi)增殖快，但持久性差，有可能引起早期細(xì)胞因子風(fēng)暴（CRS）；而Kymriah^TM在病人體內(nèi)增殖慢，但持久性好，有可能引起延遲的CRS。

7      Kymriah^TM和Yescarta^®都是針對CD19和B細(xì)胞淋巴瘤，先后于2017年首次獲批上市。它們療效顯著，但也存在著很大的改進(jìn)空間。

8 Kymriah^TM和Yescarta^®兩個細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)過程復(fù)雜，需要對每個患者單獨制備，很難產(chǎn)業(yè)化，導(dǎo)致價格居高不下，因此限制了它們的銷售。另外這一代CAR-T適用范圍窄，很難應(yīng)用到實體瘤上。而且其副作用大，在一些患者中引起CRS， 甚至導(dǎo)致死亡。眾多生物技術(shù)和制藥公司正研發(fā)新一代CAR-T技術(shù)，從商業(yè)性和產(chǎn)品性能兩大方面進(jìn)行改進(jìn)，希望能克服這些局限性。

9   若想進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)品性能，CAR-T技術(shù)必須解決五大挑戰(zhàn)：（1）滲入：如何讓T細(xì)胞有效地進(jìn)入實體瘤的內(nèi)部；（2）識別：如何讓T細(xì)胞高精度地識別腫瘤細(xì)胞，而不濫傷無辜；（3）持久：如何保證T細(xì)胞擴(kuò)增到足夠多的數(shù)量、存活至足夠長的時間，從而鏟除所有的腫瘤細(xì)胞；（4）破境：如何使T細(xì)胞克服腫瘤周圍的免疫抑制性的微環(huán)境（TME）；（5）控制：如何能有效地控制、調(diào)節(jié)T細(xì)胞的啟動、關(guān)閉、活性、持續(xù)時間和作用地點。

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10   改進(jìn)CAR-T的產(chǎn)品性能也正是從這五個維度下手。對實體瘤來說，“滲入”和“破境”是前提。而對所有腫瘤而言，提高療效的重點是改進(jìn)“識別”和“持久”，提高安全性的重點則是完善“識別”和“控制”。

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11   第二代CAR-T和第一代相比，主要在“持久”方面得到了很大的改進(jìn)?，F(xiàn)在各個公司在開發(fā)新一代CAR-T時，各顯神通，專攻一個或多個維度。我們可以預(yù)見，未來的CAR-T產(chǎn)品，除了需要在這五個維度上做到完美，還要提高其商業(yè)性——降低成本、合理定價、開發(fā)通用型（off-the-shelf）CAR-T。通用型CAR-T細(xì)胞是指消除或降低了引起免疫排斥的風(fēng)險的異體細(xì)胞，可批量生產(chǎn)，而不必針對每個患者單獨制備。

圖片來源：參考資料5

12   CAR-T不同于小分子藥或蛋白藥。它是“活”的藥，而且可以添加很多功能。改進(jìn)CAR-T的一個方向是借鑒系統(tǒng)生物學(xué)/合成生物學(xué)的理論，引入傳感器、邏輯門、邏輯電路等概念，把它打造成一個機(jī)器人或智能系統(tǒng)。CAR-T is an engineered cell. Then why don’t we engineer the heck out of it?

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13    沿著這一思路，加州大學(xué)（舊金山）的Wendell Lim教授發(fā)明了SynNotch技術(shù)。SynNotch是一種合成的Notch受體，通過基因工程在T細(xì)胞表面永久性地表達(dá)。我們可以把它看作一種新型的CAR，其膜外結(jié)構(gòu)也是抗體片段，識別并結(jié)合抗原A。A的結(jié)合引起SynNotch的膜內(nèi)肽鏈被裂解，釋放出連接的轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，特異性地啟動第二個CAR的轉(zhuǎn)錄。第二個CAR表達(dá)后，插入細(xì)胞膜，如果遇到第二個抗原B，會進(jìn)一步激活下游信號，進(jìn)入殺傷模式。SynNotch技術(shù)相當(dāng)于給T細(xì)胞裝了一個“與門”， 只有在接觸到的細(xì)胞表達(dá)兩種抗原A和B的情況下，才會被激活。

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14     SynNotch技術(shù)在小鼠實驗中已被驗證。小鼠左側(cè)接種單抗原腫瘤，右側(cè)接種雙抗原腫瘤。靜脈注射的人源SynNotch CAR T 細(xì)胞（CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞1：1的混合）只對雙抗原的腫瘤有療效。

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15    SynNotch CAR-T療法的優(yōu)勢是能夠更精準(zhǔn)地殲滅（表達(dá)兩種抗原的）腫瘤細(xì)胞，而不傷害患者體內(nèi)健康的（只表達(dá)一種抗原的）細(xì)胞或組織。其缺點是從CAR1被激活到CAR2被激活有一個時間差，因此無法做到雙靶點同步激活。

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16   很少有實體瘤只依靠一個表面抗原就能被區(qū)分。因此，識別多靶點的SynNotch CAR-T技術(shù)除了可以減少副作用外，還可以擴(kuò)展CAR-T的靶向空間。

圖片來源：參考資料6

17   除了SynNotch CAR-T技術(shù)，Lim的團(tuán)隊還發(fā)明了Throttle^TM技術(shù)——用小分子藥開關(guān)CAR-T。以這兩個技術(shù)為基礎(chǔ)，Lim于2015年創(chuàng)立了Cell Design Labs公司。Cell Design Labs與另一家CAR-T公司Kite有合作關(guān)系。2017年，在Gilead并購了Kite之后，Kite/Gilead幾個月后又收購了Cell Design Labs。首付1.75億美元，再加上各種里程碑，收購價最高可達(dá)5.67億美元。

18 一個故事的結(jié)束往往意味著另一個故事的開始。 Wilson Wong博士曾在Wendell Lim的實驗室做了將近5年的博士后。2012年初，Wong離開了北加州，來到波士頓大學(xué)任職。他也按著合成生物學(xué)的思路創(chuàng)造了一個新的CAR-T技術(shù)——SUPRA CAR，并于2018年2月聯(lián)合創(chuàng)立一家生物技術(shù)公司Senti Biosciences來開發(fā)這一技術(shù)。

19   Senti Bio的其他幾名聯(lián)合創(chuàng)始人也是赫赫有名，包括MIT的Tim Lu和Jim Collins。公司的技術(shù)平臺除了SUPRA CAR外，還包括小分子CAR-T開關(guān)和加強(qiáng)型免疫細(xì)胞（Advanced Arming）。

20   Senti Bio在CAR-T中引進(jìn)了更多的邏輯門。除了多靶點識別的“與門”（A AND B)外，還有“或門”(A OR B)和SAND (“A NOT B”)。每種邏輯門的功效不同，可以根據(jù)實際需要靈活選擇。

21    SUPRA CAR技術(shù)可以幫助實現(xiàn)這些邏輯門。SUPRA CAR系統(tǒng)中，CAR蛋白被分拆，成為兩個蛋白：zipCAR和zipFv。zipCAR是跨膜蛋白，其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)是一個亮氨酸拉鏈，而zipFv是一個融合scFv，裝有同源亮氨酸拉鏈，可以與zipCAR上的亮氨酸拉鏈互補(bǔ)結(jié)合。這個系統(tǒng)將CAR-T模塊化，帶來了更大的靈活性。其治療模式是細(xì)胞治療加蛋白治療。對不同的腫瘤，只需一種zip-CAR-T細(xì)胞，但需要更換不同的傳感器——zipFv。SUPRA CAR系統(tǒng)可以通過改變以下幾個變量來調(diào)整其特性：（1）亮氨酸拉鏈對之間的親和力，（2）腫瘤抗原和scFv之間的親和力，（3）zipFv的濃度，和（4）zipCAR的表達(dá)水平。

圖片來源：參考資料1

22   SUPRA CAR技術(shù)在小鼠腫瘤模型中已經(jīng)得到驗證。單獨輸入RR zipCAR T細(xì)胞并不能減少腫瘤負(fù)荷。只有同時引進(jìn)EE zipFv蛋白后，RR zipCAR T + EE zipFv（RRzip與EEzip互補(bǔ)）才能有效抑制腫瘤，其活性接近于一個傳統(tǒng)的CAR-T（a-Her2 CAR）。

圖片來源：參考資料1

23    SUPRA CAR系統(tǒng)實現(xiàn)的“或門”展示。將表達(dá)雙抗原的K562腫瘤細(xì)胞與表達(dá)RR-zipCAR的CD8 + T細(xì)胞共同培養(yǎng)，加入兩種識別單抗原的zipFv中的任何一種都能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞起到殺傷作用。

圖片來源：參考資料1

24   SUPRA CAR系統(tǒng)實現(xiàn)的可調(diào)性“與門”展示。RR zipCAR和FOS zipCAR分別裝備了CD28 / 4-1BB共刺激域和CD3z信號域，信號傳導(dǎo)相對獨立。a-Her2 zipFv與FOS zipCAR結(jié)合，進(jìn)一步被抗原Her2激活后，指令下傳給CD3z結(jié)構(gòu)域，繼而增加CD69的表達(dá)；而a-Axl zipFv與RR zipCAR結(jié)合，進(jìn)一步被抗原Axl激活后，指令下傳給CD28 / 4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域，繼而增加了IFN-g等細(xì)胞因子的釋放。改變每個zipFv的濃度可以調(diào)節(jié)來自每個受體的信號輸出強(qiáng)度，而且這兩個通路有很強(qiáng)的協(xié)同作用。

圖片來源：參考資料1

25   SUPRA CAR系統(tǒng)實現(xiàn)的“A AND NOT B”邏輯門展示。一種免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)基因后，其表面會表達(dá)兩種zipCAR，其中一種的膜內(nèi)域被激活后會抑制另一種的信號通路。在這個例子中，a-Her2 zipFv通路激活了免疫細(xì)胞，但加入a-Axl zipFv會抑制免疫細(xì)胞的激活，從而減弱了對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

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26   SUPRA CAR的優(yōu)勢是其靈活性、可調(diào)性、多功能性、可編程性和應(yīng)用廣泛性。它主要存在兩個缺點：（1）這種治療方法是細(xì)胞療法和蛋白藥療法的組合，給生產(chǎn)、申報、給藥增加了復(fù)雜性。（2）由于zipFv是一種游離的scFv，體內(nèi)半衰期短。若想維持CAR-T的療效，需要不斷補(bǔ)充scFv。Senti Bio將如何揚(yáng)長避短，挖掘出這一技術(shù)的最大潛力？我們將繼續(xù)關(guān)注。

圖片來源：參考資料9

27    Senti Bio只是研發(fā)新一代CAR-T技術(shù)的公司之一。目前僅在美國就有幾十個相似的或相競爭的生物技術(shù)公司。每個公司的技術(shù)各有千秋，但最終目標(biāo)都是改進(jìn)CAR-T的產(chǎn)品性能或商業(yè)性能。

28    醫(yī)藥界渴望的是開發(fā)出針對實體瘤的通用型CAR-T。只有實現(xiàn)了這一目標(biāo)，CAR-T才能“跨越鴻溝"，從小眾產(chǎn)品轉(zhuǎn)變?yōu)榇蟊姰a(chǎn)品，以更好地造福人類。（完）

參考資料：

1.Cho, J. H., et al. (2018). "Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses." Cell 173(6): 1426-1438 e1411.

2.Cross, R. (2018). Controlling CAR-T: How scientists plan to make the engineered T cell therapy safer, and work for more cancers. Chemical & Engineering News. 96.

3.June, C. H., et al. (2018). "CAR T cell immunotherapy for human cancer." Science 359(6382): 1361-1365.

4.Kitada, T., et al. (2018). "Programming gene and engineered-cell therapies with synthetic biology." Science 359(6376).

5.Lim, W. A. and C. H. June (2017). "The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer." Cell 168(4): 724-740.

6.Roybal, K. T., et al. (2016). "Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits." Cell 164(4): 770-779.

7.Wu, M. R., et al. (2019). "Engineering advanced cancer therapies with synthetic biology." Nat Rev Cancer 19(4): 187-195.

8.“Deciphering CAR T cells: Exploring functional mechanisms to drive next generation immunotherapy “ Riddell, S. and Lim, W. Science Webinar 04/11/2019

9. Dr. Gary Lee's talk at “Science Alliance: Advancements in Immuno-Oncology” JLABS Symposium 04/04/2019