近年來，以免疫細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤治療方法在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。隨著細(xì)胞工程的發(fā)展，嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞療法在治療血液腫瘤方面取得了巨大的成功。然而，基于T細(xì)胞的免疫療法有一定的局限性，包括對(duì)自體細(xì)胞來源的限制，以避免人類白細(xì)胞抗原(HLA)不匹配引起的嚴(yán)重副作用。這種個(gè)性化治療的必要性不可避免地導(dǎo)致了巨大的制造和時(shí)間成本，降低了許多患者的可及性。作為一種替代策略，自然殺傷(NK)細(xì)胞已經(jīng)成為改進(jìn)基于細(xì)胞的免疫療法的潛在候選者。NK細(xì)胞能夠直接殺死癌細(xì)胞，而不需要HLA配型。此外，基于NK細(xì)胞的療法可以使用不同的同種異體細(xì)胞來源，這使得“現(xiàn)成”免疫療法成為可能，副作用減少，生產(chǎn)時(shí)間縮短。

目前基于NK細(xì)胞的免疫療法也存在一些限制，需要加以解決以實(shí)現(xiàn)廣泛的臨床轉(zhuǎn)化。首先，對(duì)于長期的治療方案，需要提高NK細(xì)胞在體內(nèi)的持久性。其次，提高基因工程抗原受體的持續(xù)時(shí)間和穩(wěn)定性對(duì)于產(chǎn)生強(qiáng)有力的治療反應(yīng)至關(guān)重要。第三，需要開發(fā)更有效、更安全的NK細(xì)胞工程系統(tǒng)，以取代廣泛使用的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)策略，以實(shí)現(xiàn)更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并提高修飾后的NK細(xì)胞活性。為了解決這些局限性，人們研究了許多基因和表面工程方法來加強(qiáng)NK細(xì)胞的免疫治療（圖1）。對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行基因工程的方法可以分為病毒類和非病毒類。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于工程逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體將所需的基因結(jié)構(gòu)送入細(xì)胞。非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)包括電穿孔、CRISPR-Cas9、納米顆粒和Trogocytosis等介導(dǎo)的方法。本文就NK細(xì)胞進(jìn)行基因工程的方法做一個(gè)簡單介紹。

圖1. 用于工程自然殺傷(NK)細(xì)胞的輸送技術(shù)

利用病毒載體進(jìn)行NK細(xì)胞基因工程

病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)，目前基于病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞技術(shù)正在臨床使用。然而，為了轉(zhuǎn)染臨床需求的NK細(xì)胞，需要大量的病毒，這增加了制造的復(fù)雜性和成本。此外，插入突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)仍然是病毒載體的一個(gè)重要問題。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是最早用于NK細(xì)胞工程的載體之一，通過IL-2 cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)NK細(xì)胞以增強(qiáng)細(xì)胞在體內(nèi)的持久性。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在NK細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，這可能部分歸因于NK細(xì)胞對(duì)病毒載體的固有防御機(jī)制。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)需要快速地分裂細(xì)胞以獲得最大轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。其他提高逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法通常包括使用IL-2和K562細(xì)胞預(yù)激活NK細(xì)胞，以及多輪轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過這些增強(qiáng)策略，NK-92細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可以從60%到90%，而這對(duì)原代NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，約為50%左右。

慢病毒載體

慢病毒與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，它不需要主動(dòng)分裂細(xì)胞，因此能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)更多類型的NK細(xì)胞，因此比逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一些潛在的優(yōu)勢(shì)。原代NK細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常依賴于促進(jìn)病毒進(jìn)入的化學(xué)試劑，如陽離子聚丙稀烯和魚精蛋白硫酸鹽。然而，這些試劑已經(jīng)顯示出對(duì)NK-92細(xì)胞的毒性，因此替代試劑，如DEAE-葡聚糖和多聚-L-賴氨酸，近年來也被使用。此外，無毒的陽離子多肽，如維甲酸，已被用于轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞來源的NK細(xì)胞，并顯示出比化學(xué)試劑更高的轉(zhuǎn)染效率。

利用非病毒載體進(jìn)行NK細(xì)胞基因工程

為了減輕對(duì)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的擔(dān)憂，人們已經(jīng)探索和開發(fā)了用于NK細(xì)胞工程的新的非病毒傳遞方法。目前已知用于NK細(xì)胞基因工程的非病毒轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、Trogocytosis介導(dǎo)的方法，以及幾種基于納米顆粒的遞送系統(tǒng)，如電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運(yùn)體(CARTs)和脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)。

電穿孔

電穿孔是最早和應(yīng)用最廣泛的非病毒轉(zhuǎn)染策略之一。一個(gè)短的電脈沖作用于細(xì)胞，以產(chǎn)生暫時(shí)的通透性，并允許編碼感興趣基因的DNA或RNA的注入。研究表明，攜帶mRNA的NK細(xì)胞在質(zhì)粒DNA上的電穿孔顯著提高了轉(zhuǎn)染效率，在靜止的人原代NK細(xì)胞和體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率都達(dá)到了80-90%。此外，Boissel 等人觀察到電穿孔導(dǎo)致NK-92細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。電穿孔介導(dǎo)的CD19和CD20-CAR-NK-92細(xì)胞對(duì)惡性淋巴細(xì)胞株的殺傷活性明顯高于慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92細(xì)胞。Shimasaki 等人在一項(xiàng)臨床前研究中，報(bào)道了電穿孔的人NK細(xì)胞在對(duì)抗B細(xì)胞白血病方面的有效效果。他們還觀察到，電穿孔后細(xì)胞存活率的中位數(shù)維持在90%左右，并且表達(dá)抗CD19-CAR的NK細(xì)胞與CD19+靶細(xì)胞相互作用時(shí)分泌干擾素-γ的細(xì)胞毒性增強(qiáng)。

除了血液癌，電穿孔NK細(xì)胞被證明對(duì)實(shí)體瘤有效。Liu等人報(bào)道了電穿孔轉(zhuǎn)染編碼HER2-CAR的質(zhì)粒DNA的NK-92細(xì)胞治療乳腺癌細(xì)胞的研究。結(jié)果表明，HER2-CAR-NK-92細(xì)胞在電穿孔后保持了60-90%的細(xì)胞存活率，并在小鼠乳腺癌模型中表現(xiàn)出明顯的腫瘤組織浸潤和腫瘤生長抑制。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了電穿孔NK-92細(xì)胞治療實(shí)體瘤的潛在臨床可行性。然而，盡管電穿孔比病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)更安全，但有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡和對(duì)細(xì)胞膜造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，從而限制了其臨床潛力。

Trogocytosis介導(dǎo)的方法

當(dāng)淋巴細(xì)胞，如B、T和NK細(xì)胞，與抗原呈遞細(xì)胞相互作用，可以通過免疫突觸從這些細(xì)胞繼承表面分子。研究表明，這也發(fā)生在淋巴細(xì)胞和靶細(xì)胞之間，如癌細(xì)胞。Somanchi等人通過將NK細(xì)胞與表達(dá)趨化因子受體CCR7的K562“供體”細(xì)胞系共培養(yǎng)，證明了Trogocytosis在工程人NK細(xì)胞以增強(qiáng)淋巴結(jié)歸巢方面的潛力。結(jié)果表明，與K562細(xì)胞共培養(yǎng)1h后，80%的NK細(xì)胞表達(dá)CCR7，并促進(jìn)NK細(xì)胞向淋巴結(jié)的遷移。

還探索了Trogocytosis方法作為一種非病毒傳遞方法將CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到NK細(xì)胞的潛在用途。將高表達(dá)抗CD19 CARS抗體的K562“供體”細(xì)胞與PB-NK細(xì)胞共培養(yǎng)1h后，發(fā)現(xiàn)18.6%的NK細(xì)胞表達(dá)抗CD19-CAR抗體，且這些NK細(xì)胞對(duì)B-ALL細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)。然而，Trogocytosis介導(dǎo)的受體轉(zhuǎn)移很容易丟失。獲得性蛋白的快速丟失大大限制了Trogocytosis工程N(yùn)K細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。因此，進(jìn)一步的研究對(duì)于提高以Trogocytosis為基礎(chǔ)的NK細(xì)胞修飾的持久性和穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。

CRISPR-CAS9系統(tǒng)

簇狀、規(guī)則間隔、短回文重復(fù)(CRISPR)相關(guān)蛋白9(CAS9)系統(tǒng)已被廣泛用作靶向基因編輯的高性價(jià)比和高效率工具。CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過在引導(dǎo)RNA的指導(dǎo)下由Cas9核酸酶誘導(dǎo)雙鏈斷裂，實(shí)現(xiàn)了可定制的特異性。然后，該系統(tǒng)插入具有非同源末端連接或同源定向修復(fù)途徑的感興趣的基因序列。Pomeroy等人的一項(xiàng)研究報(bào)道了CRISPR-Cas9介導(dǎo)的敲除關(guān)鍵抑制信號(hào)分子ADAM17和PDCD1以改善PB-NK細(xì)胞功能的概念驗(yàn)證結(jié)果。該方法有效地修飾了90%的PB-NK細(xì)胞，增加了免疫抑制劑TME的細(xì)胞因子產(chǎn)生和腫瘤細(xì)胞毒性。此外，該研究小組還將編輯的PB-NK細(xì)胞擴(kuò)大到臨床需求的細(xì)胞數(shù)量，而不損失細(xì)胞活性，證明了CRISPR-Cas9工程N(yùn)K細(xì)胞的臨床潛力。

電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運(yùn)體(CARTs)

McKinlay 等人報(bào)道了一種用于將mRNA遞送到免疫細(xì)胞的新遞送系統(tǒng)，稱為電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運(yùn)體(CARTs)。具體地說，CARTs最初充當(dāng)陽離子，以非共價(jià)方式絡(luò)合、保護(hù)并向免疫細(xì)胞運(yùn)送mRNA。一旦進(jìn)入細(xì)胞膜，CARTs就會(huì)經(jīng)歷生物降解，并分解成小的、無毒的、中性的分子，釋放功能性mRNA來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)(圖2)。

圖2. 電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運(yùn)體(CARTs)技術(shù)

      使用CARTs，Wilk等人將編碼抗CD19-CAR的mRNA導(dǎo)入原代人NK細(xì)胞。Wilk等人結(jié)果表明，CARTs介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)染與大劑量電穿孔介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)，但總體細(xì)胞存活率更高。此外，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)染的原代NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞株具有更好的細(xì)胞毒作用。此外，與電穿孔相比，CARTs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染對(duì)NK細(xì)胞表型和蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響最小。因此，這種CARTs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染策略在癌癥免疫治療的臨床中的應(yīng)用和加深對(duì)NK細(xì)胞生物學(xué)的理解方面都是很有前途的。

脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)

為了介導(dǎo)核酸的胞漿遞送以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)已被開發(fā)為一種非病毒遞送系統(tǒng)，它能夠保護(hù)核酸貨物不被核酸酶降解，并介導(dǎo)內(nèi)體逃逸。LNPs由一種可電離的脂質(zhì)成分組成，它在生理pH下帶中性電荷，在酸性的內(nèi)質(zhì)體室中帶正電荷，從而允許貨物釋放到胞漿中。除了可電離脂質(zhì)，LNPs通常由三種額外輔料組合而成：用于改善穩(wěn)定性和增強(qiáng)膜融合的膽固醇成分，用于幫助體內(nèi)逃逸和包裹貨物的輔助磷脂成分，以及用于最小化LNP聚集的脂質(zhì)錨定聚乙二醇結(jié)合物(圖3)。一些研究已經(jīng)研究了LNPs在轉(zhuǎn)染各種免疫細(xì)胞中的使用。Billingsley等人報(bào)道了使用可電離LNPs利用mRNA產(chǎn)生人CAR-T細(xì)胞。該方法通過LNPs將CAR mRNA傳遞到人類T細(xì)胞，誘導(dǎo)瞬時(shí)CAR表達(dá)。這種方法顯示了與傳統(tǒng)電穿孔技術(shù)相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染效率，但細(xì)胞存活率顯著提高，體外抗腫瘤細(xì)胞毒性增強(qiáng)。根據(jù)LNP介導(dǎo)的CAR T細(xì)胞的設(shè)計(jì)理念，可以設(shè)計(jì)類似的LNP系統(tǒng)來設(shè)計(jì)用于癌癥免疫治療的CAR-NK細(xì)胞。

圖3. 可電離脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)介導(dǎo)的CAR mRNA傳遞

小編總結(jié)

近年來，用于癌癥免疫治療的重定向或增強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒作用的基因工程策略正在迅速發(fā)展，并引起了越來越多的關(guān)注。越來越多的證據(jù)證明了工程N(yùn)K細(xì)胞治療各種癌癥的安全性和有效性。近年來，隨著藥物輸送和基因編輯系統(tǒng)的快速發(fā)展，CRISPR-Cas9技術(shù)和納米顆粒輸送系統(tǒng)都是非常有前途的領(lǐng)域，有可能在不久的將來迅速推進(jìn)基于NK細(xì)胞的癌癥免疫治療。

參考文獻(xiàn)

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2.Genetic manipulation of NK cells for cancer immunotherapy: Techniques and clinical implications.

3.A genetically engineered primary human natural killer cell platform for cancer immunotherapy.

4.Charge-altering releasable transporters (CARTs) for the delivery and release of mRNA in living animals.

      5.Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.