重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV) 載體與其他病毒載體相比, 具備感染能力強(qiáng)、可持續(xù)表達(dá)目的基因、無致病性和非基因組整合等優(yōu)點(diǎn), 已成為體內(nèi)基因治療的主要病毒載體。

本文總結(jié)了rAAV基因治療產(chǎn)品的最新研究進(jìn)展, 從原材料、生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制等方面對此類產(chǎn)品的藥學(xué)評(píng)價(jià)考慮要點(diǎn)展開討論, 以期促進(jìn)此類產(chǎn)品的臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用。同時(shí)對3個(gè)國外已上市產(chǎn)品的藥學(xué)評(píng)價(jià)考慮要點(diǎn)及常見問題進(jìn)行討論。

rAAV基因治療產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì), 目前至少有238 個(gè)rAAV基因治療產(chǎn)品正在開展臨床試驗(yàn), 3 個(gè)rAAV基因治療制品已在歐美注冊上市(表1)。

 

表1 rAAV基因治療產(chǎn)品的臨床應(yīng)用

 

導(dǎo)讀：

 

1、原材料相關(guān)研究內(nèi)容與評(píng)價(jià)

1.1、病毒分子設(shè)計(jì)

rAAV的載體設(shè)計(jì)應(yīng)基于臨床有效性和安全性, 一般為靶向特定組織或細(xì)胞, 刪除與毒力、致病性或復(fù)制能力相關(guān)的基因, 以確保制品的安全性。同時(shí), 設(shè)計(jì)應(yīng)考慮載體基因組的大小、包裝效率和表達(dá)效率, 并盡可能減少與體內(nèi)相關(guān)病毒的同源性, 以避免形成復(fù)制型病毒。構(gòu)建病毒的質(zhì)粒應(yīng)考慮抗生素抗性基因引入的風(fēng)險(xiǎn), 一般不得使用氨芐青霉素抗性基因。

1.2、生產(chǎn)細(xì)胞基質(zhì)

目前產(chǎn)業(yè)界用于rAAV生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)既有哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HEK293、BHK)、人腫瘤細(xì)胞系(HeLa、A549),也包括昆蟲細(xì)胞系(SF9) 等。

包裝細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行充分的鑒定并建庫。鑒定項(xiàng)目一般包括鑒別、純度、基因型/表型、成瘤性/致瘤性、遺傳穩(wěn)定性和引入序列等。除常規(guī)無菌、真菌和支原體外, 尤其要關(guān)注細(xì)胞基質(zhì)的種屬特異性病毒。如: HEK293 細(xì)胞應(yīng)檢定CMV、HIV-1/2、HILV-1/2、HH-V6/8、JV virus、BK virus、EBV、parvovirusB19、HBV、HPV和HCV等病毒; SF9 細(xì)胞應(yīng)檢定螺原體、彈狀病毒等昆蟲病毒。

用人腫瘤細(xì)胞系作為包裝細(xì)胞, 還應(yīng)充分評(píng)估其致瘤性和成瘤性的風(fēng)險(xiǎn), 以及致瘤病毒的感染情況等, 如: HeLa 細(xì)胞為來自人子宮頸癌組織的腫瘤細(xì)胞, 已知含有50 個(gè)拷貝數(shù)的HP

 

2、生產(chǎn)工藝相關(guān)研究與評(píng)價(jià)

2.1、AAV制品上游工藝

2.1.1、多質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)法

最早的rAAV 生產(chǎn)工藝采用質(zhì)粒、輔助病毒感染包裝細(xì)胞生產(chǎn)。目前采用較多的是三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293 生產(chǎn)工藝, HEK293 細(xì)胞中含有腺病毒(adenovirus, AdV) 的E1a 和E1b 基因, 共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(含目的基因和ITR序列)、結(jié)構(gòu)質(zhì)粒(含rep/cap 基因) 和輔助質(zhì)粒( 復(fù)制病毒基因E2A, E4,VARNA 等), 48～72 h 后即可重組包裝rAAV。

該方法適用于多種血清型rAAV, 發(fā)酵產(chǎn)率一般可達(dá)每毫升1014 V.G. (vector genome), 一般可滿足早期臨床試驗(yàn)rAAV用量(<1015 V.G.)。但是, 受貼壁培養(yǎng)方式所限, 多質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)工藝較難滿足商業(yè)化生產(chǎn)需求(>1016 V.G.)。

2.1.2、穩(wěn)轉(zhuǎn)生產(chǎn)細(xì)胞法

構(gòu)建含有輔助基因rep/cap和目的基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa 細(xì)胞系, 經(jīng)腺病毒感染后也可包裝出rAAV 病毒。尤其是采用可懸浮培養(yǎng)的HeLa S3細(xì)胞系, 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞生產(chǎn)法可直接放大至2 000 L規(guī)模。與之類似, 構(gòu)建含有ICP27 基因的BHK 細(xì)胞,經(jīng)轉(zhuǎn)染含有輔助基因和目的基因的復(fù)制缺陷型d27.1HSV后, 也可高效表達(dá)rAAV。

但是, 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞法的主要缺點(diǎn)在于, 細(xì)胞構(gòu)建和遺傳穩(wěn)定性研究較為耗時(shí),且生產(chǎn)過程中使用輔助病毒存在病毒安全性風(fēng)險(xiǎn)。

2.1.3、桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞法

桿狀病毒具有高度的種屬特異性, 不感染脊椎動(dòng)物, 能將rAAV基因和輔助功能的反式作用元件轉(zhuǎn)移至SF9 昆蟲細(xì)胞中。因此, 近年也開始應(yīng)用于rAAV 的大規(guī)模生產(chǎn)。該方法的優(yōu)勢在于桿狀病毒生物安全性好, 感染效率高, 生產(chǎn)工藝便于放大。但質(zhì)量控制項(xiàng)目中也應(yīng)考慮桿狀病毒及DNA相關(guān)物質(zhì)殘留。

藥學(xué)評(píng)價(jià)要點(diǎn)：

對于rAAV 上游生產(chǎn)工藝, 藥學(xué)評(píng)價(jià)建議關(guān)注關(guān)鍵工藝的工藝開發(fā)與驗(yàn)證, 如采用多質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或加入輔助病毒等工序中, 應(yīng)通過工藝開發(fā)與驗(yàn)證說明關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制范圍及中間體驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn), 如不同載體配比、轉(zhuǎn)染試劑用量、輔助病毒與生產(chǎn)細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)等。

2.2、AAV制品下游工藝

2.2.1、純化工藝

rAAV 純化工藝一般包括細(xì)胞培養(yǎng)液收獲、化學(xué)法/物理法裂解細(xì)胞、benzonase 酶消化去除核酸物質(zhì)、多步層析和密度梯度離心、置換制劑處方緩沖液等工序, 其中, 親和層析模擬細(xì)胞受體的結(jié)合作用捕獲rAAV。如: 硫酸肝素填料可特異性結(jié)合rAAV2, AVB瓊脂糖填料可結(jié)合1、2、3、5 和8 等多種血清型rAVV[22]。對于空載體的去除, 目前多采用碘克沙醇和氯化銫超速離心法。

值得關(guān)注的是, 中國藥典相關(guān)總論中明確指出,“除另有證明其合理性外, 不得使用氯化銫-溴化乙錠密度離心法進(jìn)行基因治療產(chǎn)品的純化”。

2.2.2、病毒清除驗(yàn)證

如上所述, 采用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞或穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(HeLa) 生產(chǎn)工藝時(shí)會(huì)使用桿狀病毒或輔助病毒(HSV、Ad5 等)。因此, 下游工藝應(yīng)增加特定病毒去除/滅活工序。

如: 采用表面活性劑TritonX-100 (0.5%, v/v) 和增加病毒過濾工序去除收獲液中殘留桿狀病毒; 采用加入表面活性劑、低pH值滅活等工序去除HSV病毒; 采用離子交換法、短時(shí)間加熱(52 ℃、10 min) 和納濾等工序去除腺病毒等。

2.2.3、制劑處方

由于rAAV衣殼蛋白對溫度和pH值變化并不敏感, rAAV 制品的制劑處方開發(fā)相對簡單。通常慣用在鹽溶液中加入200 mmol·L-1硫酸鎂或0.001%泊洛沙姆F68 避免產(chǎn)生聚體, 基本可支持長期保存(-65 ℃) 和運(yùn)輸穩(wěn)定性。

評(píng)價(jià)要點(diǎn)：

對于rAAV 下游生產(chǎn)工藝, 藥學(xué)評(píng)價(jià)建議結(jié)合產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)、過程相關(guān)雜質(zhì)的去除效率評(píng)估純化工藝合理性與穩(wěn)健性。對于使用輔助病毒的生產(chǎn)工藝應(yīng)結(jié)合收獲液中病毒含量, 進(jìn)行病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證,綜合評(píng)估病毒的殘留安全性。

 

3、病毒清除驗(yàn)證

3.1、相關(guān)雜質(zhì)

3.1.1、工藝相關(guān)雜質(zhì)

rAAV 制品的工藝相關(guān)雜質(zhì)包括病毒包裝與純化工藝中引入的宿主蛋白、宿主DNA、輔助病毒、質(zhì)粒、血清和氯化銫等組分。由于病毒包裝細(xì)胞通常含有致癌基因, 如HEK293 細(xì)胞內(nèi)含有E1A 的腺病毒基因, HeLa 細(xì)胞內(nèi)的E6、E7 致癌基因。因此, 一般對于宿主細(xì)胞殘留DNA 含量應(yīng)小于10 ng/Dose, 且殘留DNA片段應(yīng)小于200 bp。

3.1.2、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)

rAAV 制品的相關(guān)雜質(zhì)包括未包裝基因的空病毒、包裝錯(cuò)誤基因(宿主DNA、不完整目的基因、輔助病毒基因等) 的病毒、無感染活性的病毒顆粒、聚體或氧化形式的病毒顆粒等。

這些產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)不僅不能實(shí)現(xiàn)目的基因在靶細(xì)胞的表達(dá), 還可在臨床上引起免疫原性或基因毒性。如: 多質(zhì)粒順轉(zhuǎn)體系中, 一般空病毒占比可以達(dá)到50%～98%?？詹《静痪吒腥灸芰?/span>, 且容易形成病毒聚體和降解, 引起體內(nèi)免疫反應(yīng)。因此, 質(zhì)量研究中應(yīng)采用A260/A280、透射電鏡、分析性離心和質(zhì)譜等技術(shù)檢測空病毒含量。

復(fù)制型腺相關(guān)病毒(replication-competent AAV,rcAAV) 是由于同源/非同源重組發(fā)生后, rAAV病毒同時(shí)包裝rep 和cap/AAP等基因所產(chǎn)生的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。

rcAAV在輔助病毒存在的條件下可以進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。rcAAV的檢測一般采用在輔助病毒存在下使用敏感細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增, 細(xì)胞裂解液經(jīng)過多次擴(kuò)增傳代后, 采用Southern blot 和qPCR法測定rep 或cap 基因。如: 已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的rAAV 制品scAAV2/8-LP1-hFIXco 采用qPCR 法控制rcAAV 含量限度低于1/2.25×106 。目前也有報(bào)道稱采用優(yōu)化后的多質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)工藝,rcAAV含量限度可低于1/108 V.G.。

3.2、一般質(zhì)量控制項(xiàng)目

rAAV病毒生產(chǎn)質(zhì)量控制包括過程控制與終產(chǎn)品放行檢測(表2)。

如: 病毒包裝用質(zhì)粒應(yīng)進(jìn)行鑒別、含量、純度、宿主細(xì)胞DNA殘留、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌等質(zhì)量控制;

病毒收獲液應(yīng)控制外源因子(無菌、支原體等)、外源病毒、目的病毒等檢測;

rAAV原液與制劑放行項(xiàng)目一般包括外觀、理化性質(zhì)(pH值、滲透壓)、病毒滴度(物理滴度、感染滴度)、純度(蛋白純度、吸光度比值、宿主DNA殘留、質(zhì)粒DNA殘留、核酸酶殘留)、效力(目的基因表達(dá)、體外活性、體內(nèi)活性)、安全性(內(nèi)毒素、無菌、rcAAV)。

此外, 對于眼部用藥的rAAV 制劑, 內(nèi)毒素含量應(yīng)不高于2.0 EU/dose/eye 或0.5 EU/mL, 應(yīng)按照眼用制劑控制不溶性微粒(USP<789>)、產(chǎn)品的放行檢測應(yīng)包括配置后產(chǎn)品等。

 

3.3、效力測定方法

對于rAAV 制品的效力測定方法, 應(yīng)體現(xiàn)其病毒物理滴度、感染活性及生物活性。

一般在臨床試驗(yàn)早期可采用qPCR 法測定病毒基因組, 敏感細(xì)胞或靶向細(xì)胞測定其感染能力和目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)能力表征產(chǎn)品效力。

關(guān)鍵性臨床試驗(yàn)開展后應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)反映產(chǎn)品作用機(jī)制的體外酶活法或體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)法。如:SPK-RP65 在進(jìn)入Ⅲ期臨床后, 通過轉(zhuǎn)染指示細(xì)胞(HEK293-LRAT) 后測定RPE65 蛋白酶促反應(yīng)產(chǎn)物視黃醇含量來計(jì)算產(chǎn)品效力。

值得指出的是, 對于qPCR法測定病毒基因組應(yīng)采用線性DNA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 若采用超螺旋DNA作為參照品, 載體基因組含量測定值顯著高于真實(shí)值。

4、3個(gè)已上市基因產(chǎn)品實(shí)例分析

目前, 國際上僅有3個(gè)rAAV基因治療產(chǎn)品(glybera、luxturna 和zolgensma) 獲批上市, 國內(nèi)此類產(chǎn)品多處于研發(fā)早期階段, 工業(yè)界與監(jiān)管方對于rAAV 基因治療產(chǎn)品的藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)均缺乏實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。下文擬結(jié)合國外已上市產(chǎn)品審評(píng)報(bào)告中披露信息, 對此類產(chǎn)品的藥學(xué)評(píng)價(jià)考慮要點(diǎn)及常見問題進(jìn)行討論。

4.1、Glybera

Glybera (alipogene tiparvovec, AAV1-LPLS447X)是Amsterdam Molecular Therapeutics 公司開發(fā)的攜帶人LPLS447X 基因的rAAV2 型基因治療產(chǎn)品, 臨床上肌肉注射用于治療成人脂蛋白脂肪酶缺陷癥。

本品工藝開發(fā)過程中存在重大工藝變更: 第一代生產(chǎn)工藝(AMT-010) 采用HEK293 表達(dá)系統(tǒng), 商業(yè)化生產(chǎn)工藝(ATM-011) 則采用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá), 因此開展了藥學(xué)和非臨床可比性研究。

下游工藝中采用工藝規(guī)模縮小模型對包膜病毒、非包膜病毒去除能力進(jìn)行了工藝驗(yàn)證。

質(zhì)量研究對 3 批連續(xù)生產(chǎn)批次制品進(jìn)行了充分的表征研究, 其中包括: 組分(基因組完整性/大小、蛋白質(zhì)分析、分子質(zhì)量、衣殼蛋白); 物理性質(zhì)(顆粒大小、病毒顆粒糖基化修飾); 一級(jí)結(jié)構(gòu)(序列確證、蛋白鑒定); 高級(jí)結(jié)構(gòu)(透鏡電鏡、分析超速離心); 生物活性(感染性顆粒、比活、效力) 等。

EMEA審評(píng)認(rèn)為, 由于細(xì)胞收獲液中含有大量感染性桿狀病毒, 且下游工藝不能提供足夠的病毒去除效果, 要求申請人補(bǔ)充提供臨床注射桿狀病毒殘留DNA的風(fēng)險(xiǎn)分析報(bào)告, 并建議產(chǎn)品放行檢測項(xiàng)目中增加感染性桿狀病毒殘留和rcAVV等檢查項(xiàng)目。

并且, EMEA審評(píng)建議產(chǎn)品上市后生產(chǎn)工藝應(yīng)進(jìn)一步增加桿狀病毒去除工序(如病毒過濾), 后期應(yīng)提高雜質(zhì)(包裝細(xì)胞DNA、殘留Rep/Cap 基因、rcAAV、感染性桿狀病毒等殘留) 檢測方法靈敏度。

4.2、Luxturna

Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl, SPK-RPE65)系美國Spark Therapeutics 公司研發(fā)的攜帶人RPE65基因rAAV-2 型基因治療制品, 臨床上視網(wǎng)膜下注射用于治療先天性黑朦癥。

產(chǎn)品采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染貼壁HEK293 細(xì)胞, 滾瓶生產(chǎn)工藝。生產(chǎn)工序包括: 細(xì)胞擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)基置換、收獲培養(yǎng)液、切向流過濾、均質(zhì)、離子交換色譜、密度梯度離心、制劑緩沖液置換和過濾等;

本品Ⅲ期臨床試驗(yàn)前曾發(fā)生場地、包裝容器等工藝變更, 采用“Side-by-side”法對產(chǎn)品質(zhì)量的方法進(jìn)行產(chǎn)品可比性研究。

產(chǎn)品放行檢測項(xiàng)目包括: 理化(外觀、pH值、濃度、可抽取體積)、鑒定(目的基因)、含量(基因組濃度)、效力(目的基因表達(dá)、體外活性)、純度和安全性項(xiàng)目(內(nèi)毒素、顆粒物、無菌) 等, 質(zhì)量研究中對宿主DNA、質(zhì)粒DNA、E1A 基因和牛血清蛋白等工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留進(jìn)行控制。

FDA審評(píng)認(rèn)為, 本品上市后應(yīng)繼續(xù)完成包裝細(xì)胞HKE293 穩(wěn)定性及產(chǎn)品實(shí)時(shí)穩(wěn)定性等研究。

4.3、Zolgensma

Zolgensma (onasemnogene abeparvovec, AVXS-101)系AveXis 公司開發(fā)的攜帶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白1 (survival motor neuron, SMN) 基因的rAAV9 型基因治療產(chǎn)品,臨床上靜脈注射治療兒童脊髓肌肉萎縮癥。

本品在工藝開發(fā)過程中, 結(jié)合目標(biāo)質(zhì)量屬性采用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法確定本品關(guān)鍵質(zhì)量屬性, 采用工藝規(guī)?？s小模型確定工藝設(shè)計(jì)空間并進(jìn)行工藝驗(yàn)證;

本品在關(guān)鍵性臨床試驗(yàn)開展前、注冊上市前, 先后發(fā)生場地、工藝和制劑處方等變更。

FDA 審評(píng)判定工藝變更前后產(chǎn)品純度和VG 單位效力保持一致; 本品的“效力”檢測項(xiàng)中既包括定量檢測靶細(xì)胞SMN蛋白表達(dá)水平, 也包括體內(nèi)半定量法檢測小鼠“生存率”。

值得關(guān)注的是, 由于本品在? 期臨床試驗(yàn)開展過程中“含量”分析方法缺乏精確度與準(zhǔn)確度, 44 個(gè)月后采用更新的方法重新修正臨床給藥劑量。此外, 在本品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中, 觀測到“含量”和“效力”有所下降。